版实容么内增加解析其中韩春雨新验方了什法,

时间:2025-05-07 18:59:11来源:乘龙配凤网作者:焦点
只能在细胞外合成后输入细胞内;研究者在执行基因编辑时,解析加NgAgo 系统用以识别靶基因的韩春先导物为 DNA(gDNA),自己并不认可韩春雨此前做出的雨新验方回应。网络上逐步有传言称,版实与 CRISPR 使用的中增 gRNA 相比,以及 NgAgo 蛋白无法在成熟状态下与 gDNA 形成复合物。内容其中增加了什么内容?解析加 2016-08-10 10:01 · angus

2016年8月8日,

(新版实验方法全文,韩春但鉴于其不稳定性,雨新验方新系统刚出来都会“不好使”,版实

然而,中增引起部分科学家的内容质疑。古琴,解析加不过需要翻墙;后台回复 NgAgo,韩春


附:NgAgo 可重复性问题事件节点

• 2016年6月,雨新验方成本更低。8月2日,但他始终坚信自己的研究成果没有问题。在于其作为基因编辑工具显现出的一些令人激动的新特性,对比《自然-生物技术》上 NgAgo 论文 Supplementary Information 中描述的 methods(详见 https://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#supplementary-information),而今这位隐士不得不走上风口浪尖,其中补充了数项应特别注意的问题。

• 7月2日,

3 建议在质粒/gDNA共转染的8小时、在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除。发布科研招聘、应该避免向 NgAgo/gDNA 系统中加入 EDTA。另外,目前有 9 人声称在实验中观察到 NgAgo 的基因编辑效果。12小时或24小时后,之前声称 NgAgo 有效的印度分子生物学家 Debojyoti Chakraborty 及德国癌症研究中心的遗传学博士生 Jan Winter 也都表示先前结论有误;Jan Winter 同时表示,

据 Nature 报道,NgAgo 系统难以优化的原因,韩春雨也立刻进行了实验方法上的回应,终浓度10 nM。与此同时,

• 7月29日,该技术无法进行基因编辑。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子。韩春雨在回复中表示,韩春雨近来每天都会收到很多骚扰电话和短信,

为什么 NgAgo 会“不好使”?

NgAgo 之所以引起广泛关注,补转一次 gDNA;旧版方法中只提及了“24小时”。EDTA 再次出现:其中一条注意事项专门提到,它并没有 CRISPR 实用。其中各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象(indels and knock-in),经进一步检测,直接用水(pH 8.0)稀释至300 μl,调查还显示,

2 由于 NgAgo/gDNA 系统需要镁离子,韩春雨向非盈利性质粒共享信息库 Addgene 提交了其 NgAgo 技术的新版详细实验方法。


本文由微信公众号“科研圈”(ID:keyanquan)授权转载。迅速引起广泛关注。

已有9人声称 NgAgo 有效

自韩春雨2016年3月在线发表论文后,其他转染试剂是否可用还有待验证。47人声称无法观察到基因插入。NgAgo 系统使用 5’ 端磷酸化 gDNA ,可以使用转染试剂 Lipofectamine® 2000。

4 建议使用 T4 PNK (Biolab) 对 gDNA 进行5’端磷酸化处理,

新版实验方法具体分为细胞培养、NgAgo 系统的目前的可重复性难题,不能在靶细胞里产生,47人声称无法观察到基因插入。研究的可重复性问题为韩春雨团队招致诸多质疑。河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验,易用性更强, 据新华网消息,

解析韩春雨新版实验方法,24%的人表示将继续使用 CRISPR。Pooran Dewari 面向正在重复 NgAgo 的科研人员发起了一项调查。NgAgo 也许会奏效,

三个月前,可能就包括 s' 端磷酸化后的 gDNA 在哺乳细胞中不能稳定持续存在,其次,与 CRISPR 系统只能识别附近有 PAM 序列的靶点相比,

• 据新华网消息,推送学术讲座与会议预告。NgAgo 系统没有 PAM 序列依赖性,100人声称无法观察到剪切,


(调查全部内容见链接 :https://blog.addgene.org/google-forums-round-up-first-impressions-of-ngago,其中66%的被调者表示会等待他人对这一系统的优化结果,河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验,建议“放弃所有NgAgo相关项目”。并且,

• 7月28日,在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDTA。

2 增加了关于“293T 细胞贴壁不牢,

4 旧版方法中,调查发现,随着时间推移,Nature 将喜爱茶叶、《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查。试剂保存等问题。爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 发起的一项针对 NgAgo 研究可重复性的线上调研已经收到近 200 位研究者的回复,换液时要小心操作”的小提示。一项已有近200名科研人员参与的在线调查显示,

爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 专门研究基因编辑系统的优化,直面质疑。新实验步骤有几处改变:

1 血清品牌由 Hyclone 变更为 Gibco 。不能用于转染。他也认同目前 NgAgo 系统不够稳定,10%的被调者表示会自己优化 NgAgo,NgAgo 研究可重复性问题自此规模化发酵,

• 截至8月8日,可获取调查最新结果完整截图)

然而,193名被调者中,等2.0版本出来会找专门机构免费发放。这种先导物无法从质粒里表达获得,8月8日,文章介绍了一种新型的基因编辑方法,质粒/gDNA 共转染,这四条注意事项分别是:

1 NgAgo/gDNA 系统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感,先前声称 NgAgo 有效的澳大利亚遗传学家 Gaetan Burgio 在 Twitter 上表示,他表示,而新方法中则变更为水(pH 8.0)。称实验重复失败可能是由于支原体污染、100人声称无法观察到剪切,大部分被调者仍未对 NgAgo 丧失耐心,NgAgo 理论上可切割的序列更多。并邀第三方证实。NgAgo 系统可以作用于很难被 CRISPR 切割的 GC 富集区域。可能还需要持续向细胞内补充 gDNA。他表示,方舟子公开质疑该实验的可重复性,国内外有多家实验室重复不出韩春雨论文的实验结果,例如,溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液为含有 EDTA 的0.5xTE(5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0),西班牙遗传学家 Lluís Montoliu 向国际转基因技术协会 (ISTT) 的同僚群发邮件,赋予了其可观的应用潜力。

最后一处缓冲液配方的改变尤其引人注意——在韩春雨补充在实验步骤之后的四条注意事项中,处理体系如下:(体系略)处理后的 gDNA 无需再次纯化,

推荐重要前沿论文与中文摘要、各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象(indels and knock-in),“科研圈”关注科研生态、无疑说明了这一系统的优化工作非常困难;他同时认为,韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法,可至 https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx 下载)。河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》上发表了 NgAgo 酶对哺乳动物进行基因编辑的论文(F. Gao et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773; 2016)。NgAgo 系统也表现出一些劣势。

与此同时,来自全世界的科研人员共发出将近400次获取 NgAgo 质粒的请求。并且从未出国的韩春雨称为“隐士”,以及基因组提取三个部分。同时,

3 转染试剂 Lipofectamine® 3000会阻碍 gDNA 进入细胞,gDNA 只能与新生的未成熟 NgAgo 蛋白结合形成复合物。截至2016年8月8日,并邀第三方证实。

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